Zusammenfassung
Eine immunhistochemische Färbung der gH2AX-Signale wurde durchgeführt, wobei für jeden Abschnitt eine positive und eine negative Kontrolle die Erfolgsquote dieser Färbung unterstützte. Anschließend wurde die Quantifizierung mit der HS Analysis Study Management Software (HSA KIT) durchgeführt, und die Ergebnisse bestanden einen Plausibilitätstest. Die in dieser Studie verwendeten und trainierten Modelle wurden speziell zu diesem Zweck trainiert, nämlich das „HyperNonVesselNet“ und das „HypergH2AXNet“.
Das erste Modell wurde für die automatisierte Erkennung von Gefäßen oder Erythrozyten entwickelt, um sie aus dem gesamten Nierenbereich auszuschließen und den nicht-vaskulären Bereich zu bestimmen. Das zweite Modell wurde darauf trainiert, gH2AX-Signale zu erkennen, wobei seine Anwendung auf den nicht-vaskulären Bereich als Substruktur beschränkt war. Mit diesem Ansatz konnte eine Fehlerquote von weniger als 5 % erreicht werden, und es war möglich, sowohl kleine, schwache Signale als auch große, intensive Signale zu quantifizieren.
Einführung
Intra- und extrazelluläre Einflüsse, wie radioaktive Strahlung bei der Radioimmuntherapie, können Mutationen oder DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) verursachen. Nach der Induktion von DSBs erfolgt innerhalb weniger Minuten die Phosphorylierung der Histon H2A-Variante H2AX (gH2AX). Dies kann potenzielle Gefahren für die Zelle und somit für den gesamten Organismus darstellen. Je nach Ausmaß des Schadens kann der programmierte Zelltod (Apoptose) ausgelöst oder die Zelle einer Nekrose unterzogen werden. Aus diesem Grund suchen Laboratorien nach einer Substanz, die die Nebeneffekte auf Nebenorgane während der Radioimmuntherapie schützt. Zur Überprüfung der Wirkung dieser Substanzen kann der „gH2AX Analyzer“ im HSA KIT verwendet werden, um die gH2AX-Signale zu quantifizieren, die mit den DSBs korrelieren.
Die folgenden Abschnitte beschreiben ein potenzielles Experiment, bei dem das HSA KIT in der pharmazeutischen Forschung angewendet wird. Die beschriebenen Schritte wurden genau wie skizziert durchgeführt; jedoch wurden die Ergebnisse aus Datenschutzgründen verzerrt oder ungenau wiedergegeben.
Vorteile des HSA KITs
- Evidenzbasierte Entwicklung: Das HSA KIT basiert auf Experimenten. Projekte werden archiviert, sodass Daten auch nach 2 Jahren nachvollziehbar bleiben. Dies gewährleistet, dass die verwendeten Einstellungen und Parameter auch nach langer Zeit zurückverfolgt werden können.
- Einfache Modifikation: Die Modifikation von Experimenten wird durch das Kopier-Tool des HSA KITs vereinfacht. Es ermöglicht das schnelle Kopieren von Projekten und die Bewahrung vorheriger Daten. Ein neues Projekt mit einer neuen IP wird erstellt, sodass keine vorherigen Daten verloren gehen. Anschließend können neue Bearbeitungen und Parameteranpassungen vorgenommen werden, was den Vergleich von Daten und eine potenzielle Bewertung erleichtert.
Diese Funktionen des HSA KITs verbessern die Rückverfolgbarkeit von Daten, ermöglichen effiziente Änderungen und erleichtern die effektive Auswertung experimenteller Ergebnisse.
Hintergrund dieses Experiments
Die geeigneten Versuchstiere wurden zunächst intravenös mit einer spezifischen Menge der jeweiligen Konzentrationen der Schutzsubstanz injiziert. Anschließend wurde ein gegen Prostatakrebs gerichtetes radioimmuntherapeutisches Mittel verabreicht. In diesem Fall ist ein Molekül, das gegen ein prostata-spezifisches Antigen gerichtet ist, über einen Linker an einen Chelator gekoppelt. Dieser Chelator trägt den radioaktiven Alpha-Emitter Actinium-225.
Während der Therapie reichert das Bindungsmolekül Actinium-225 im Prostatatumor an, wodurch die Tumorzellen aufgrund strahlungsinduzierter Schäden absterben. Als Nebenwirkung der auf Actinium-225 basierenden Therapie treten Nierenschäden auf. Die zweite verabreichte Substanz soll die Aufnahme von Radioaktivität in den Nieren unterdrücken und somit das Organ schützen. Das eingesetzte Radioimmuntherapeutikum bindet an ein Antigen, das sowohl in Prostatatumoren als auch in Nieren exprimiert wird, obwohl die Expression im Tumor signifikant stärker ist. Die Schutzsubstanz bindet an dasselbe Antigen, jedoch deutlich schwächer.
Das Ziel ist es, die Bindung an die schwach antigen-exprimierenden Nieren zu blockieren, sodass das Radioimmuntherapeutikum weiterhin an das Zielantigen im Tumor binden kann. Das an das Radioimmuntherapeutikum gekoppelte Ac-225 soll von den Tumorzellen aufgenommen und diese zerstören.
Das HSA KIT bietet eine effiziente Lösung zur Auswertung experimenteller Ergebnisse in der Forschung. Nach der Probenentnahme und Durchführung der immunhistochemischen Färbung können die Proben gescannt werden. Anschließend ermöglicht das HSA KIT die Quantifizierung, sodass der genaue Zeitpunkt, die Konzentration und die verwendeten Konjugate bestimmt werden können, bei denen die Schäden aufgetreten sind und deren Intensität.
Dies hilft dabei, den effektivsten Ansatz zum Schutz der Nieren während einer gezielten Radiopharma-Therapie zu identifizieren. Darüber hinaus liefert es Erkenntnisse über die Wirksamkeit der Therapie. Das Experiment kann wiederholt werden, wobei verschiedene Parameter variiert werden, um deren Einfluss auf die Schäden zu bewerten. Dieser Ansatz kann auch auf Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) angewendet werden, und es können verschiedene Radioisotope wie Lutetium-177 eingesetzt werden, deren Wirkungen mit dem HSA KIT präzise bestimmt werden können.
Krebstherapie
Antikörper sind Proteine, die vom Immunsystem produziert werden, um Krankheitserreger zu erkennen und zu bekämpfen. Im Labor können spezifische Antikörper erstellt werden, die gezielt an Krebszellen binden. Diese Antikörpertherapie zielt darauf ab, das Immunsystem auf die Anwesenheit von Krebszellen aufmerksam zu machen, sodass es diese gezielt angreifen und bekämpfen kann.
Neoadjuvante Therapien können ebenfalls eingesetzt und mit dem HSA KIT einfach bewertet werden.
Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC)
Antikörper-Wirkstoff-Konjugate stellen einen fortschrittlichen therapeutischen Ansatz dar, bei dem ein im Labor hergestellter Antikörper mit einem hochwirksamen zytostatischen Wirkstoff verbunden ist. Das Besondere daran ist, dass der zytostatische Wirkstoff inaktiv bleibt, solange er an den Antikörper gebunden ist, und erst aktiv wird, wenn er von einer Krebszelle aufgenommen wird.
Bei der Verabreichung als Medikament im Körper bindet der Antikörper gezielt an Krebszellen. Diese Bindung führt zur vollständigen Internalisierung des Antikörper-Wirkstoff-Konjugats in die Krebszelle. Innerhalb der Zelle wird der zytostatische Wirkstoff vom Antikörper getrennt. Diese Trennung aktiviert den zytostatischen Wirkstoff, der darauf abzielt, die Krebszelle gezielt zu zerstören.
Slidescanner
Das HSA-Kit kann digital generierte Mikroskopiebilder von Slide-Scannern (wie dem Axio Scan Z.1) erkennen und analysieren. Es unterstützt Bildformate wie .tiff, .czi und .jpg.
Implementierung
Um die Erkennung der gH2AX-Signale zu optimieren, wurden zwei Deep-Learning-Modelle trainiert. Das erste Modell, genannt „HyperNonVesselNet“, ist darauf ausgelegt, Erythrozyten und Blutgefäße zu erkennen. Es teilt die gesamte Niere in nicht-vaskuläre und vaskuläre Bereiche. Das Ziel ist es, die relevanten Bereiche oder Objekte in einem Bild zu identifizieren und sie vom Hintergrund und/oder anderen Objekten zu trennen.
Das zweite Modell, „HypergH2AXNet“, wird als Substruktur im nicht-vaskulären Bereich angewendet.
Signal-Erkennung mit dem HSA KIT
Um die Plausibilität der Softwareergebnisse zu überprüfen, wurden die Abschnitte einzeln untersucht. Alle vom HSA KIT automatisch erkannten Strukturen wurden berücksichtigt, einschließlich des nicht-vaskulären Bereichs, Erythrozyten oder Gefäßen und gH2AX-Signalen. Zunächst wurde die gesamte Niere untersucht, um größere Fehler auszuschließen.
Das Basis-ROI (Region of Interest), das früher erwähnt wurde, wird durch die schwarze Umrisslinie der Niere in Abbildung Xa dargestellt. Dies definiert den zu quantifizierenden Bereich, und alle erkannten und analysierten Signale befinden sich innerhalb dieser Markierung. Der Bereich außerhalb dieser Markierung ist mit schwarzen Diagonallinien gefüllt, was darauf hinweist, dass dieser Bereich von der Quantifizierung ausgeschlossen ist. Die rot markierten Strukturen repräsentieren Erythrozyten oder Gefäße.
Aufgrund der automatischen Erkennung dieser Strukturen muss der Ausschluss von Blutgefäßen und roten Blutkörperchen nicht manuell durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Definition des nicht-vaskulären Bereichs, der in Gelb dargestellt ist (Abbildung Xb). Innerhalb dieses Bereichs werden die gH2AX-Signale quantifiziert, die in Schwarz dargestellt sind (Abbildung Xc). Für die Ergebnisberechnung dient der nicht-vaskuläre Bereich als Grundlage für die gesamte Niere, da er nur Zellen enthält, in denen potenziell DNA-Schäden auftreten können.
Zusätzlich, um die Qualität der Ergebnisse zu bewerten, werden die als Signale erkannten Färbungen angezeigt und ausgeblendet und untersucht. Letzteres wurde durchgeführt, um einen besseren Vergleich zu ermöglichen und festzustellen, ob diese Stellen Signale darstellen oder nicht. Bildabschnitte wurden mit einer 40-fachen Vergrößerung im HSA KIT aufgenommen und im Laufe der Studie verglichen.
Die als Signale erkannten Strukturen sind in Abbildung Xa grün hervorgehoben. Der rot markierte Bereich wurde von der Software als Erythrozyt erkannt. Der nicht-vaskuläre Bereich, der normalerweise gelb erscheinen würde, wurde in beiden Bildabschnitten für eine bessere Übersicht ausgeblendet. Es ist zu beobachten, dass keine Signale innerhalb der Erythrozyten erkannt werden. Als Beispiel sind rote Blutkörperchen im Bild violett umkreist. Diese Strukturen zeichnen sich durch einen Hohlraum aus, der mit gelblichen, unregelmäßigen Strukturen gefüllt ist.
Sowohl die Hohlräume als auch die Strukturen darin können in Größe und Form variieren. Das Modell wurde darauf trainiert, nur größere Blutgefäße und Blutkörperchen (>100 μm) zu erkennen, da kleinere häufig zwischen den Zellen vorhanden sind (lila) und die Qualität der Ergebnisse nicht negativ beeinflussen, da das Modell sie nicht fälschlicherweise als positiv erkennt. Weitere Details hierzu und zum Trainingsprozess wurden im Abschnitt „Training“ erläutert.
Wie im Bildausschnitt zu sehen ist, wurden diese Strukturen nicht als Signale erkannt. Zudem wurden keine Strukturen in diesem Bildausschnitt fälschlicherweise als gH2AX-Signale identifiziert, was darauf hinweist, dass an dieser Stelle keine falsch positiven Ergebnisse erzeugt wurden. Darüber hinaus zeigt der Bildausschnitt, dass kein falsch negatives Signal erkannt wurde. Jedes deutliche Signal, unabhängig von seiner Größe, das in Abbildung X vorhanden ist, wurde von der Software korrekt erkannt. Daher liegt die Fehlerquote an diesem Punkt sowohl für falsch positive als auch für falsch negative Ergebnisse bei 0 %.
Automatisierte Flächenberechnung der gH2AX-Signale mit dem HSA KIT
Die Dateinamen im folgenden Abschnitt wurden fiktiv erstellt und spiegeln nicht die tatsächlichen Ergebnisse des Experiments wider, sondern vielmehr den tatsächlichen Prozess.
Die gescannten OTs wurden mit dem HSA KIT analysiert. Die Parameter wurden anhand der Färbungsintensität optimiert und angepasst, indem verschiedene Einstellungen angewendet und überprüft wurden, die später detaillierter erläutert werden. Das Ziel war es, den gesamten Bereich jedes einzelnen Signals zu erfassen und die Erkennung unspezifischer Färbungen und roter Blutkörperchen zu minimieren.
Durch den Vergleich der Ergebnisse unterschiedlicher Einstellungen wurde ein Konfidenzwert von 0,70 als optimal befunden. Dieser Parameter gibt das Vertrauensniveau der Software in die von ihr erkannten Signale an und reicht von 0 bis 1. Zusätzlich wurde ein Bereich von 0 bis 5.000.000 μm2 für den Größenbereich festgelegt, in dem Signale erkannt werden sollten. Da die Bereiche von DNA-Doppelstrangbrüchen stark variieren können, wurde diese Option nicht weiter berücksichtigt.
Sobald die Parameter optimiert waren, wurde das Modell auf die Proben angewendet und die Fläche der gH2AX-Signale automatisch von der Software berechnet. Die Gesamtfläche der Nieren wurde ebenfalls automatisch berechnet, um einen Vergleich zwischen den gesamten Schadensflächen und den Nierenflächen zu ermöglichen. Zusätzlich wurde der Prozentsatz der Schäden innerhalb der dreifachen Bestimmungen gemittelt und die Standardabweichung berechnet (Tabelle 1).
Um diese Werte zu visualisieren, erstellte das HSA KIT ein Balkendiagramm, das den Prozentsatz der DNA-Schäden relativ zur Gesamtfläche der Niere darstellt. Die gemittelten Werte der Schäden aus den 3 behandelten Tieren pro Gruppe und Zeitpunkt wurden verwendet. Die Standardabweichungen wurden ebenfalls berücksichtigt.
Zusätzlich zur Gesamtschadensfläche relativ zur gesamten Nierenfläche erstellt das HSA KIT automatisch ein Säulendiagramm, das die Gesamtzahl der γH2AX-Signale pro mm2 für jedes Tier angibt.
Es ist zu erkennen, dass die Tiere aus Gruppe 1, die nur zwei Stunden mit der Substanz inkubiert wurden (dunkelblaue Balken), eine geringere Menge an Schäden aufweisen. Der Balken, der die 15-Stunden-Werte der Gruppe 1 (orange) zeigt, weist den niedrigsten Schadensgrad auf. Die Tiere aus Gruppe 2, die für 2 Stunden inkubiert wurden (grau), zeigen ein ähnliches Schadensniveau wie Gruppe 3 (grün). Die Gruppe 3, die die höchsten Schäden aufweist, wurde für 2 Stunden inkubiert (hellblau).
Das Säulendiagramm legt nahe, dass die Gruppennummer einen Einfluss auf das Ausmaß der DNA-Schäden hat. Wenn die Inkubationszeit konstant bleibt (2h oder 15h) und sich nur die Gruppennummer ändert, wodurch sich die Konzentration der Substanz ändert, steigt die Anzahl der Schäden signifikant an.
Die eingefügten Standardabweichungen zeigen kein klares Muster von Zunahme oder Abnahme.
Diskussion
Basierend auf dem in der Ergebnissektion präsentierten Säulendiagramm kann gefolgert werden, dass die Konzentration der Substanz der entscheidende Faktor ist. Zwei Zeitpunkte und drei verschiedene Konzentrationen wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der Schäden sowohl in Bezug auf die Fläche als auch auf die Menge mit höherer Substanzkonzentration zunahm.
Mit dem HSA KIT ist es möglich, bestimmte Parameter entsprechend den Abschnitten anzupassen. Dabei wurde darauf geachtet, diese Parameter so zu wählen, dass die automatische Erkennung möglichst vieler manuell identifizierter γH2AX-Signale ermöglicht wurde. Darüber hinaus wurde der gesamte Bereich dieser Signale berücksichtigt, da später in der Studie die Berechnung der Signalfläche vorgesehen war. Ein Konfidenzwert von 0,70 wurde als optimal befunden. Sowohl kleine als auch große γH2AX-Signale wurden als solche erkannt und ihre gesamten Bereiche erfasst.
Bei der manuellen Untersuchung einzelner Abschnitte wurde festgestellt, dass einige Gewebeschnitte eine besonders intensive braune Hintergrundfärbung aufwiesen. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die endogene Peroxidaseaktivität nicht vollständig blockiert wurde, was zu einer Mitfärbung von weißen und roten Blutkörperchen führte. Daher wurden diese Abschnitte speziell auf falsch-positive Ergebnisse überprüft, da die zu detektierenden Signale ebenfalls braun gefärbt waren. Es wurde festgestellt, dass bis auf wenige Signale keine signifikant hohe Anzahl von Fehldetektionen erzielt wurde. Die Fehlerquote lag bei weniger als 5 % sowohl für falsch-positive als auch für falsch-negative Detektionen.
Darüber hinaus könnte unspezifische Färbung durch unvollständige Entfernung des Paraffins entstanden sein, da es die spezifische Färbung maskieren kann. Außerdem könnten unzureichendes Spülen der Gewebeschnitte oder eine Überentwicklung der Substratreaktion aufgrund einer übermäßigen Menge an Chromogen in der Lösung zu unspezifischen Färbungen geführt haben. Da es sich um eine schnelle Färbemethode handelte, wurden hochkonzentrierte Reagenzien und relativ kurze Inkubationszeiten verwendet.
Infolgedessen führten bereits zusätzliche Sekunden während der Inkubation zu erheblichen Veränderungen, wie dem Austrocknen der Schnitte, das hauptsächlich an den Rändern der Nieren auftrat. Diese unspezifischen Färbungen wurden ebenfalls nicht als falsch-positive erkannt.
Der Recall-Wert betrug 0,995 und der Präzisionswert 0,966, was darauf hinweist, dass es mehr falsch-positive Ergebnisse (d. h. ein Signal wurde erkannt, obwohl es nicht vorhanden war) als falsch-negative Detektionen gab. Dies konnte an der Anzahl der falsch-negativen (FN) und falsch-positiven (FP) erkannt werden. Keine der berechneten Werte wich jedoch signifikant von 1 ab, was darauf hinweist, dass das Modell für die genaue Quantifizierung von γH2AX-Signalen geeignet war. Der harmonische Mittelwert, der F1-Score, betrug 0,980 und bestätigte damit weiter, dass es sich um ein geeignetes Deep-Learning-Modell handelte.
Metriken
Um die Qualität des Modells weiter zu untersuchen, wurden Metriken berechnet. Zu diesem Zweck wurde eine Region einer Niere ausgewählt und gH2AX-Signale manuell detektiert.
Insgesamt wurden 434 Strukturen annotiert. Anschließend wurde das zu untersuchende Modell HyperH2AXNet auf denselben Bereich des Abschnitts angewendet.
Mit dem DL-Modell wurden insgesamt 447 Objekte als Signale erkannt. Im nächsten Schritt wurde ein Vergleich mit dem HSA KIT durchgeführt, um festzustellen, welche manuell annotierten Signale automatisch vom Modell erkannt wurden und welche nicht. Basierend darauf wurden die Werte für die Anzahl von FN (falsch negative), TN (richtig negative), FP (falsch positive) und TP (richtig positive) gezählt. Es wurden die folgenden Werte erzielt: FN: 2 TN: unbestimmbar FP: 15 TP: 432 Unter Verwendung dieser Werte und der Gleichungen (1.1) bis (1.4) wurden die Metriken Genauigkeit, Präzision, Recall und F1-Score berechnet. Da die TN-Werte unbestimmbar sind, wurden sie nicht weiter berücksichtigt. Es wurden die folgenden Werte ermittelt: Genauigkeit = 0,962; Präzision = 0,966; Recall = 0,995; F1-Score = 0,980 Der Recall-Wert ist der höchste unter allen Werten, gefolgt vom F1-Score. Der Präzisionswert ist geringfügig höher als die Genauigkeit.
HSA KIT vs. ImageJ vs. QuPath
HSA KIT
ImageJ
QuPath
Um die Ergebnisse besser zu vergleichen, wurde eine Zoomstufe von 80 verwendet.
HSA KIT
ImageJ
QuPath
Anschließend wurden die Lösungen in einer Tabelle zusammengefasst.
Mit diesen Daten wurde ein Säulendiagramm erstellt, bei dem die blaue Säule das HSA HypergH2AXNet, die schwarze Säule ImageJ und die letzte (gelb) QuPath ist. Die Metriken Präzision, Recall und F1-Score wurden für jede von ihnen berechnet, um die Methoden besser vergleichen zu können.
Wenn man alle Säulen vergleicht, sieht man, dass das Modell „HypergH2AXNet“ die Säule mit dem höchsten Durchschnittswert aller Modelle hat. ImageJ und QuPath liegen ungefähr auf demselben Niveau.
Manuelle Plausibilität
Eine manuelle Plausibilitätsanalyse wurde durchgeführt, um zu bewerten, ob die numerischen Werte, die mit der automatisierten Quantifizierungssoftware (HSA KIT) erhalten wurden, im Vergleich zu den Abschnitten plausibel erschienen.
Jeder Abschnitt wurde manuell im HSA KIT untersucht und sowohl innerhalb der jeweiligen Gruppen als auch über die Gruppen hinweg verglichen. Da die Schäden vergleichbare Größen hatten, konnte die Anzahl der Schäden mit der Größe gleichgesetzt werden, was die Plausibilitätsanalyse der Größenwerte basierend auf der Anzahl der Schäden ermöglichte.
Um qualitative Aussagen über das Ausmaß der Schäden zu treffen, wurden Abschnitte aus derselben Region der Niere zum Vergleich herangezogen. Die gH2AX-Signale wurden innerhalb eines Bereichs von 200 μm x 200 μm bei 20-facher Vergrößerung gezählt, und die Anzahl der Signale in den Abschnitten innerhalb der Gruppen wurde verglichen.
Um den Umfang dieser Studie zu wahren, wurde für jede Gruppe und jeden Zeitpunkt nur ein Tier oder Bereich der Niere dargestellt und verglichen. Der gesamte Nierenabschnitt ist unten abgebildet, und der ausgewählte Bereich ist durch das blaue Kreuz markiert.
Die Nierenabschnitte a) und d) zeigen auf den ersten Blick keine unspezifische Färbung, während dies bei den beiden anderen Zeitpunkten der Fall ist. Eine bräunliche, verschwommene Färbung erstreckt sich über den Großteil der Niere. Betrachtet man die Niere a), so ist ersichtlich, dass diese Probe die wenigsten Schäden aufweist. Es wurde nur ein Signal mit einem Durchmesser von etwa 3 μm beobachtet. Der 6. Zeitpunkt b) zeigt etwa 25 deutliche Signale. In Bezug auf die Größe reichen diese Signale von 3 bis 5 μm. Der Abschnitt c) zeigt 39 Schäden. Hier sind auch gelegentlich Signalkomplexe zu finden, was zu einem Größenspektrum von 3 bis 10 μm führt. Im letzten Abschnitt d) wurden 54 Signale gezählt. Auch hier sind größere Komplexe zu finden, die eine Größe von etwa 10 μm aufweisen.
Außer bei der Niere c) ist keine unspezifische Färbung erkennbar. Der 14. Zeitpunkt a) zeigt einen relativ kleinen DNA-Schaden von etwa 2 μm. Der Abschnitt aus b) zeigt ebenfalls nur ein Signal, aber dieses Signal besteht aus mehreren nuklearen Schäden, was zu einer etwa fünfmal größeren Gesamtdimension führt, nämlich 9,5 μm. Der nächste Zeitpunkt zeigt 8 Schäden, darunter ein Signal, das in der Größe dem des vorherigen Zeitpunkts vergleichbar ist. Die restlichen Signale haben eine Größe von etwa 5 μm. Im Abschnitt d) sind deutlich mehr Signale vorhanden, die größere Komplexe mit einem Durchmesser von etwa 5 bis 10 μm bilden. Insgesamt wurden 74 Signale gezählt.
Eine unspezifische bräunliche Färbung ist ebenfalls nur im Abschnitt c) zu erkennen. Der Abschnitt a) zeigt 4 deutliche Signale mit einer Größe von etwa 3 μm. Der nächste Abschnitt zeigt 7 Signale im gleichen Größenbereich wie die Signale aus a). Der Abschnitt c) zeigt 11 gH2AX-Signale, darunter mehrere größere Signale mit einer Größe von etwa 5 bis 6 μm. Im Abschnitt d) sind 34 Signale zu beobachten, von denen einige einen Durchmesser von etwa 8 bis 10 μm aufweisen, also etwa doppelt so groß wie die in a) oder b) erzeugten Signale.